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重庆细胞实验室来电咨询「英瀚斯」抖音满汉全席什么梗
2023-12-27 15:06  浏览:28
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7分钟前 重庆细胞实验室来电咨询「英瀚斯」[英瀚斯2eefa30]内容:Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。WST-8【化学名:2-(2-甲氧ji-4-硝ji苯ji)-3-(4-硝ji苯ji)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】,是一种类似于MTT的化合物,它在电子载体1-甲氧ji-5-甲ji吩嗪鎓硫酸二jia酯(1-Methoxy PMS)存在的情况下,被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物(formazan)。三、自噬过程进行观察和检测1、观察自噬体的形成由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。细胞增殖越多越快,颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅,对于同样的细胞,颜色的深浅与活xi胞的数量成正比,因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

三、自噬过程进行观察和检测

1、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。同时结合其它细胞标记物,双重染色,可判断增殖细胞的种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义。自噬体(AV1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2 )的特征为:单层膜,胞浆成分己降解。( autophagic vacuolo AV )

2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长,不利于监测(Monitoring) 自噬形成,人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。25克胰酶蛋白酶(活力为1:250),加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank's液溶解,滤器过滤chu菌,4°C保存,用前可在379C下回温。无自噬时,GFP-LC3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时,GFP-LC3融合蛋白转 位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。

3、利用Western Blot检测LC3-II/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时,胞浆型LC3 (即 LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-ID,因此,LC3-II/比值 的大小可估计自噬水平的高低。(注意: LC3对LC3-II有更高的亲和力,会造成假阳性。2%的琼脂糖和2xDMEM培养基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后,取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~10mL),冷却凝固,可作底层琼脂置CO2温箱中备用。方法2和3需结合使用,同时需考虑溶酶体活性的影响。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ,单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体,所有酸性液泡都被染色,故属于非特异性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色,但其能染所有的液泡,故也属于非特异性的。

软琼脂培养克l隆形成试验基本步骤:

(1)取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活l细胞计数,用含20%胎牛血l清的DMEM培养液调整细胞密度至1x106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。

(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后,维持在40日中不会凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2xDMEM培养基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后,取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10mL),冷却凝固,可作底层琼脂置CO2温箱中备用。

(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2xDMEM培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入0.2mL的细胞悬液,充分混匀,注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中,逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后,置入37回5%CO2温箱中培养10~14天。

(5)把平皿放置在倒置显微镜下,观察细胞数。计算形成率。软琼脂培养法常用检测肿l瘤细胞和转化细胞系。相较于直接对进行基于蛋白质分析的测序相比,得益于基因测序技术的发展,杂交瘤测序可以提供更准确更可靠的结果,防止蛋白测序中如亮氨酸/异亮氨酸较难区分等潜在风险。试验中琼脂与细胞相混时,琼脂温度不宜超过40日。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个,一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖,不适用于软琼脂克l隆形成试验。

软琼脂集落形成率实验(软琼脂克l隆)

将1.2%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合制备0.6%的底层琼脂,6孔板中每个孔1.4ml温室凝固,取对数期细胞,胰酶消化后吹散成单个细胞悬液,计数,并调细胞浓度为10000个/ml,将0.6%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合,制备0.3%的上层琼脂,每孔加1ml 上层琼脂和100ul单细胞悬液(约1000ell/wel), 混匀,室温凝固。溶解,比色:加入MTT检测试剂,按操作要求孵育相应时间,在mei标仪内检测对照组和实验组的吸光值。置于37目,5%CO2的细胞培养箱中培养2-3周,计数含50个细胞以上得克l隆,计算细胞集落形成率,Spotll 采集图像。

2、快速脂质体转染法操作步骤如下 [方法二]:

(1) 以 5×105 细胞/孔接种 6 孔板 (或 35 mm 培养皿) 培养 24 小时,使其达到 50~60% 板底面积。

(2) 在试管中配制 DNA/脂质体复合物方法如下:

①在 1 mL 无 DMEM 中稀释 PSV2-neo 质粒 DNA 或供体 DNA。

②旋转 1 秒钟,再加入脂质体悬液,旋转。

③室温下放置 5~10 分钟,使 DNA 结合在脂质体上。

(3) 弃去细胞中的旧液,用 1 mL 无 DMEM 洗细胞一次后弃去,向每孔中直接加入 1 mL DNA/脂质体复合物,37℃ 培养 3~5 小时。

(4) 再于每孔中加入 20%FCS 的 DMEM,继续培养 14~24 小时,

(5) 吸出 DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜 10%FCS 的 DMEM,2 mL/孔,再培养 24~48 小时。

(6) 用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定。

3、稳定的脂质体转染方法如下:

(1) 接种细胞同前,细胞长至 50% 板底面积可用于转染。

(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前 (2)、(3) 步骤。

(3) 在每孔中加入 1 mL、20%FCS 的 DMEM,37℃ 培养 48 小时。

(4) 吸出 DMEM,用 G418 选择培养液稀释细胞,使细胞生长一定时间,筛选转染,方法参照细胞筛选法进行。

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